文献速读 | 人类正常和乳腺癌类器官的长期培养、基因操作和异种移植

摘要：

类器官技术改变了针对个人的人体器官发育、疾病和治疗反应的研究。尽管有详细的方案可用于从各种器官生成和长期繁殖人类类器官，但缺乏此类方法用于乳腺组织。这里我们提供了一种优化后且高度通用的方案，用于长期培养来自正常人乳腺组织或乳腺癌（BC）组织的类器官。此外，我们还提供了通过Lipofectamine 2000，电穿孔或慢病毒进行遗传操作以及随后的类器官选择和克隆培养的方法。从组织碎片衍生的类器官到第一次分裂需要7-21天;遗传操作克隆类器官培养物的生成需要14-21天;异种移植的类器官扩增需要大于4 周。

实验设计

我们先介绍以前发表过的一种扩增培养基的制备方法（称为 "类型 1"；表1）。此外，我们还介绍了另一种扩展培养基，类似于为长期卵巢癌类器官培养物开发的扩展培养基称为 "2 型"；表1），它可以改善某些类器官培养物的生长特性（图 2a）。在1型或2型培养基中生长图像显示，与1型相比，2型的类器官生长速度更快。我们建议在 1 型和 2 型扩增培养基中培养新建立的类器官培养物，以确定每个供体的最佳培养基类型。在这里我们使用了自制的 R-spondin-1、Noggin 和 Wnt3a 条件培养基。

表1 添加到adDMEM/ f12++中生成第1类和第2类介质的组分，以及每种介质的最终浓度

图1. 类器官的衍生、培养和传代

建立类器官培养体系后，将患者切除材料切成小块，彻底清洗并用胶原酶消化，洗涤和过滤后，将消化的组织置于基底膜提取物（BME）中并补充扩增培养基（图1b，c）。BME 是一种在高于 10℃的温度下聚合的凝胶状物质，用于模拟细胞外基质并为 3D 类器官提供支持（图1d、e）图d为类器官清洗后的代表性图像：无颗粒（左）、含有残留 BME 的颗粒（中）和干净的颗粒（右）。基底膜基质可以用作具有相似性能的 BME 的替代品（图1f）。类器官最适合用于含有少量脂肪和坏死组织的组织。生成类器官所需的上皮组织通常表现为坚硬、粉红色至褐色的组织，而坏死组织通常较软、颜色较深。脂肪组织柔软，呈白色至黄色，很容易刮除或切掉。

类器官可在其建立7-21d 后进行传代，也可在上一次分裂后按1:2-1:8的比例进行传代。新建立的类器官培养物的传代时间和分裂比例应根据汇合情况进行优化。最佳通过时间是在 BME 液滴中心的类器官开始死亡（表现为碎屑脱落或颜色变深）之前，或者类器官直径大于 300μm（进一步称为 "汇合井"）时。我们既描述了通过胰蛋白酶化（图1g）进行的单细胞类器官传代，也描述了通过机械破碎（称为剪切）（图1g）进行的类器官碎片传代。

我们还提供了以适当的类器官密度进行培养的指南，并介绍了如何最大限度地减少细胞死亡和识别汇合的类器官（图1h-j）。此外，我们还介绍了长期储存和低温保存后恢复的程序和条件。我们建议为每个新建立的类器官培养物在早期（<5 期）至少冷冻保存 6 个冷冻瓶。

我们讨论了三种不同的乳腺类器官基因修饰方法，包括用于中高效瞬时转染的Lipofectamine 2000、用于高效瞬时转染的电穿孔和慢病毒感染实现稳定的 DNA 转导（图2a-c）。特定条件（例如 DNA 浓度、病毒滴度和类器官细胞数量）或设置（例如用于电穿孔的电压）需要针对每个实验和培养进行优化。我们建议使用带有荧光标记的对照转染或转导载体来评估程序的效率（图2b-e）。

如果已引入抗性基因，则可以通过添加抗生素或通过添加或去除其他培养基成分来选择转基因类器官。例如，添加 Nutlin-3a 将杀死所有表达野生型 P53 的细胞，并可用于选择 P53 突变的类器官（图2c）。此外，停用表皮生长因子（EGF）可以选择过表达 KRAS23 的细胞。我们建议确定每种选择剂和类器官培养物的最佳浓度，这通常是100%杀死未处理类器官的最低浓度。单个器官组织的选择和繁殖可用于产生克隆培养（图 2d、e）。未经处理的类器官应作为对照。虽然可以对每个类器官培养物的亚克隆进行评估，但我们建议使用单细胞传代后能有效扩增的类器官培养物，以提高成功率。

图2乳腺类器官的基因操作 a.乳腺类器官基因操作的示意图。解离的类器官可以与基于 Lipofectamine 2000 的转染混合物一起孵育 (A)、电穿孔 (B) 或与高滴度慢病毒一起孵育 (C) 并铺板于 BME 中。b.用表达荧光报告基因和单引导 RNA 或 Cas9 的慢病毒转导后培养 7 天的正常乳腺类器官的代表性荧光图像 c.正常乳腺类器官（对照）或通过 CRISPR-Cas9 敲除 P53 和 PTEN 并用 Nutlin-3a (10 μM) 处理 7 天的正常乳腺类器官的代表性明场图像。d,e.单个类器官 (d) 或多个类器官 (e)的代表性图像，这些类器官经过基因编辑以在嘌呤霉素选择 14 天后稳定表达 H2B::mNeonGreen 和嘌呤霉素抗性基因。

移植需要大量的类器官，通常每个注射部位需要 0.25×10⁶到 1×10⁶个完整的类器官细胞，以获得比单细胞更好的移植率。

预期结果

来源于BC组织的类器官可以表现为固体形态(约60%的培养物)、囊状形态(<5%)、葡萄状形态(约20%)或混合形态(约20%)(图3a,b)。BC类器官的生长速度差异很大，但在一些供体中可以达到很高的扩张速度(每周1:6).一旦建立(例如，> 5代体外)，BC 有机体很少停止生长或降低生长速度。大多数 BC 亚型的类器官建立效率在 55% 到 70% 之间，三倍体阴性乳腺癌（TNBC；图 3c,d）的类器官建立效率约为 40%。这表明，通常具有侵袭性和基因不稳定的 TNBC 细胞要适应体外培养条件非常具有挑战性。不过，由于这些数据是在我们优化方法时收集的，若参照表1，成功率可能会大大提高。

与原始肿瘤标本的免疫组化比较显示，器官组织在培养时有时会失去 ER（约 25% 的样本）、PR（约 25% 的样本）或 HER2（约 20% 的样本），很少有样本获得ER（约10%）或HER2（<5%）表达（图3e，f）。培养过程中受体表达减少或增加的时间可能各不相同，应针对每个培养物进行评估。这些变化的原因目前尚不清楚，但可能受到在 1 型或 2 型扩增培养基中繁殖器官组织、培养诱导的基因沉默或某些亚克隆的生长等因素的影响。值得注意的是，肿瘤切除后生成的器官组织可能会受到正常细胞的污染，预计这种情况在肿瘤样本中约占 10%。不过，由于正常的器官组织一般生长缓慢，最终会停止生长 ，因此正常细胞很可能会随着时间的推移在培养过程中丢失。当肿瘤携带 p53 突变时，可在扩增培养基中加入 Nutlin-3a 以选择肿瘤细胞，确保所有可能存在的正常细胞死亡（图 2c）。我们利用 BC类器官说明了在体外ER+ BC 有机体中结合 CDK4/6 抑制剂靶向 BCL2 的潜力 ，并进一步证明了 BC 培养物在体外可保留对阿法替尼阻断 HER2 的反应性或抵抗性。

图3.BC 类器官培养物性状   a，BC类器官不同形态的代表性图像。b，圆环图描绘了 31 个 BC 类器官培养物的主要形态分布。c，155 个组织样本和 95 个相关类器官培养物中 BC 亚型的分布。d，堆积条形图显示类器官建立的成功率，按受体表达状态分组。“是”表示成功建立（> 5 次体外传代）；‘No’表示建立不成功。 e，堆积条形图，显示与原始组织受体状态相比，具有阳性（绿色）或阴性（粉色）受体状态的类器官培养物的百分比。 f，BC 组织和衍生类器官的比较免疫组织化学图像，受体阳性 (pos) 和受体阴性 (neg) 样本的代表性图像。

我们提供不同的选择来改变基底细胞、管腔祖细胞和成熟管腔细胞的比例。这些操作可用于特定细胞类型的短期研究，但会影响培养物的形态和长期生长。此外，我们使用CRISPR-Cas9对正常乳腺类器官进行了基因编辑，表明正常类器官中的P53、PTEN和RB1突变足以将它们转化为类器官，在体内异种移植后形成ER+肿瘤。这说明了该模型在增强对最终形成 BC 特定亚型的早期分子项目的理解方面有潜在效用。

文章更多实验方案及步骤见文献https://doi.org/10.1038/s41596-020-00474-1