文献速读 | 患者来源的肺癌器官组织作为体外癌症模型用于治疗筛选

摘要：

肺癌在遗传和表型上具有很大的个体差异性，因此亟需个性化医疗。本文报告了由患者组织建立的肺癌类器官和正常支气管类器官，包括肺癌和非肿瘤性支气管粘膜的五种组织学亚型，作为代表个体患者的体外模型。肺癌类器官概括了原发性肺肿瘤的组织结构，并在体外长期扩增期间维持了原始肿瘤的基因组改变。正常支气管类器官保持正常支气管粘膜的细胞成分。肺癌类器官组织根据其基因组改变对药物产生反应：BRCA2突变类器官组织对奥拉帕利(olaparib)，表皮生长因子受体突变类器官组织对厄洛替尼(erlotinib)，表皮生长因子受体突变/MET扩增类器官组织对克唑替尼(crizotinib)产生反应。考虑到从类器官建立到药物试验的时间很短，我们新开发的模型可能会被证明有助于通过体外患者特异性药物试验预测患者特异性药物反应。

前言

气管支气管和肺泡组织的类器官模型是由成体干细胞或多能干细胞培育而成，并在体外再现了这两种不同组织类型的上皮组织作为肺癌的个性化模型，体外组织培养或使用三维培养系统的肿瘤球状体培养已被研究用于预测抗癌疗法的反应，但其生长或对原始肿瘤结构的再现有限。最近，目前已有利用气道类器官培养系统培养肺癌类器官(LCOs)的研究的报道。但这一方法在肺癌特异性生长和代表肺癌的多样性方面存在一些局限性。本文概述了从原发性肺癌组织(LC 组织)和配对的非肿瘤性气道组织中衍生出的类器官，建立了一个包含五种亚型肺癌的80个LCO株和五种正常支气管类器官(NBOs)的生物库。证明新建立的LCO和NBO生物库保持了各自亲本组织的组织学和遗传学特征，有望用于患者特异性药物试验以及靶向治疗和耐药机制的概念验证研究。

结果

01 LCO 由癌症组织的五种亚型建立

为了从LC组织中建立LCO，我们在Matrigel中使用最小基础培养基(MBM)开发了一种3D培养方案，这是一种由于Wnt3a和Noggin耗尽而抑制正常细胞生长的次优培养基。MBM含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及补充胰岛素和转铁蛋白的N2。将手术切除的LC组织分离成单个细胞或细胞簇，包埋在 Matrigel中，然后浸没在MBM中。尽管与其他含有多种试剂和生长因子(包括 FGF-10、FGF-4、FGF-7、Noggin和Wnt3a)的方案相比，我们的 MBM 所含试剂和生长因子较少，但从LC组织中提取的LCO始终呈圆形，如图1a所示。如图1b所示，这些LCO在6个月内长期扩增，球形类器官形态没有任何变化，并通过标记物Ki67免疫标记保持增殖能力(图a-c)。此外，我们尝试使用小活检组织进行类器官培养，以确定我们的培养方案是否适用于从不可操作的临床环境中获得的样本。如图1d所示，活检细胞成功培养形成类器官。从肺癌的五种亚型中储存了80个LCO系，包括上面生成的20个LCO：腺癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌、大细胞癌和小细胞癌(图1e)。类器官生物库的关键因素之一是冷冻保存的类器官的有效重建。因此，我们对生物库中冷冻保存的类器官进行了解冻测试。总体而言，在我们的3D培养方案中，56个LCO中有39个(70%)成功重建了原始组织的类器官形态和组织学特征(图1f)。

综上所述，证明了LCO培养方案是建立肺癌类器官生物库的一种有效且可重复的方法。

图1

02 NBO维持支气管上皮组织

在评估致癌作用和药物毒性时，组织控制正常很重要。为了解决这个问题，解剖了与癌症组织相邻的非肿瘤性支气管粘膜，并使用次优MBM在与LCO相同的培养条件下进行培养。起初，这些正常的支气管细胞形成类器官;在随后的传代培养中，它们未能形成类器官(图2a)。Wnt信号传导的诱导和BMP/TGFβ信号传导的抑制可促进组织更新;在培养基中添加了以下肺发育补充剂：Noggin(BMP和TGFβ信号阻断剂)和A83-01(一种活化素受体样激酶(ALK)抑制剂)以抑制BMP和TGFβ信号通路，以及Wnt3a以诱导Wnt信号。在这些补充剂的作用下，支气管细胞经过10次传代成功形成了器官组织。在这种情况下，NBO具有与先前报道的正常肺类器官相似的圆形.当这些类器官生长时，从第4次传代开始出现出芽管状类器官，并在随后的10次传代中保持长期扩增的形态(图2a)。数据表明，这些类器官具有假分层的上皮细胞，由基底细胞和管腔细胞组成，包括分泌细胞和纤毛细胞，与正常支气管粘膜组织中相同(图2b)。免疫荧光(IF)显示，器官组织由外层细胞中表达 p63 的基底细胞以及管腔细胞层中表达 MUC1的粘蛋白分泌细胞(杯状细胞)和表达乙酰化微管蛋白和Arl13b的纤毛细胞组成(图2c)。此外，一些器官组织还包括表达 CC10的棒状细胞(图2c)。然而，NBOs中细胞类型的分布与LCOs不同。腺癌器官组织中只有MUC1阳性细胞，纤毛细胞很(2d)，鳞状细胞癌类器官由p63阳性细胞组成，纤毛细胞很少。NBO和LCO的纤毛类型不同;NBO有大束的运动纤毛，在内层细胞的管腔表面，但LCO中的细胞具有初级纤毛，每个细胞仅有一根附属物(图中的黄色框。2c-e)。在此，我们证明了NBO代表了正常支气管粘膜的空间排列。

图2

03 用于体外患者特异性药物试验的 LCO

为了评估我们的LCO是否可用于体外药物敏感性测试，我们生成了几种药物的剂量反应曲线，并计算了半数最大抑制浓度(IC50).多西紫杉醇，靶向细胞微管50，在各种LCO以及具有不同敏感性的NBO中诱导细胞死亡。值得注意的是，NBO 非常容易受到细胞毒性药物多西他赛 (IC50= 0.08 μM)与靶向药物奥拉帕尼(IC50= 69μM)，厄洛替尼(IC50> 100 μM)和克唑替尼(IC50= 3μM)(图3a-c，f)，g免疫印迹分析显示厄洛替尼和克唑替尼治疗后介导 EGFR 信号传导和 c-Met 信号转导的蛋白表达发生变化。两个LCO，LCO-43和LCO-51用1μM厄洛替尼和1μM克唑替尼处理24、48和72小时，GAPDH用作上样对照(图3g)。

图3

结果表明，我们的LCO可用于预测体外患者特异性药物反应，以及基于基因改变的新靶向药物的概念验证研究。

综上，建立的LCO重现了五种最常见肺癌亚型的组织学和遗传学特征。LCO还保持了亲代肺癌的基因组异质性。研究表明，LCO系统将成为药物筛选和新临床试验的有用平台。此外，NBO还可用于评估药物对非癌细胞的毒性。考虑到从建立到药物测试的时间较短，模型可用于预测特定患者的药物反应以及更广泛的临床前研究。